ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA FLAVONOID

Prosedur Penelitian Ekstraksi dan Fraksinasi Flavonoid

Ekstraksi senyawa flavonoid yang terdapat dalam tumbuhan dengan sampel daun sirih merah ( Piper crocatum Ruiz & Pav) yang telah dihaluskan sebanyak 250 gram dimaserasi yaitu direndam dengan menggunakan pelarut metanol 10 x 1000 mL dan disimpan ditempat yang terlindung cahaya matahari sambil sekali – kali dikocok (Shaker). Maserasi dilakukan berulang kali sampai diperoleh larutan yang bening yang menandakan hasil yang negatif terhadap flavonoid. Hasil maserasi disaring dan dipekatkan dengan rotary evaporator . Ekstrak yang diperoleh disebut sebagai ekstrak pekat metanol. Kemudian dilakukan proses fraksinasi terhadap ekstrak pekat metanol tersebut berdasarkan pada perbedaan kepolaran pelarut organik. Fraksinasi untuk masing – masing fraksi dilakukan berulang kali, sampai warna pelarut pada fraksi yang diinginkan bening. Caranya adalah sebagai berikut; ekstrak kasar (ekstrak pekat metanol) dilarutkan dalam pelarut metanol – air (6 : 4), kemudian fraksinasi dengan pelarut n- heksana dengan perbandingan 1 : 1(v/v). Fraksinasi dilakukan dengan corong pisah, sehingga diperoleh 2 fraksi, yaitu fraksi n– heksana dan fraksi metanol - air. Kemudian dilanjutkan dengan fraksinasi antara fraksi metanol – air dengan pelarut etil asetat dengan perbandingan 1 : 1. Sehingga dihasilkan 3 fraksi, yaitu fraksi metanol – air, fraksi etil asetat dan fraksi n– heksana. Pada fraksi etil asetat dilakukan uji fitokimia untuk mengetahui ada tidaknya senyawa flavonoid, kemudian fraksi etil asetat ini dipekatkan dengan rotary evaporator.

Pemisahan dan Pemurnian Flavonoid

Dari hasil uji fitokimia yang dilakukan, dapat diketahui pada fraksi etil asetat mengandung senyawa flavonoid. Kemudian fraksi etil asetat dilakukan uji KLT untuk mencari komposisi eluen yang baik dengan cara melihat hasil pemisahan noda yang ada. Komposisi dari eluen yang digunakan, dan penampak noda yang digunakan adalah uap iodin. Penampak noda iodin merupakan pereaksi lokasi umum untuk senyawa organik, untuk senyawa tak jenuh akan memberikan noda – noda yang tak berwarna, tetapi banyak senyawa organik yang jenuh akan menimbulkan noda – noda berwarna coklat. Semua warna ini akan cepat hilang dibiarkan diatmosfer (Sastrohamidjojo, 2001). Dimana komposisi eluen tersebut akan digunakan sebagai fase gerak pada proses selanjutnya, yaitu n-heksan 100 %, n-heksana dan etil asetat dengan perbandingan 90:10; 80:20; 70:30; 60:40; 1;1; 40:60; 30:70; 20:80; 10:90 dan etil aetat 100% pada kromatografi kolom.

Fraksi etil asetat lalu dikromatografi kolom dengan fase gerak n- heksana : etil

asetat (20:80) dan fase diam silika gel 60 (35 – 70 mesh). Silika gel disuspensikan lebih dahulu dengan n– heksana : etil asetat (20:80) dimasukkan ke dalam kolom yang dasarnya telah diberi kapas. Kemudian didiamkan selama satu malam. Ekstrak dari fraksi etil asetat dilarutkan dengan sedikit etil asetat, yang kemudian disebut preadsorbsi. Hasil preadsorbsi dimasukkan ke dalam kolom, dielusi dengan n– heksana dan etil asetat (20:80) secara bertahap (Hostettmann, 1995).

Hasil dari kromatografi kolom yang telah didapatkan ditampung didalam vial

masing – masing 10 mL, selanjutnya diamati dengan KLT dengan eluen n – heksana : etil asetat (20:80) dan penampak noda digunakan asam sitroborat dan diamati dengan lampu UV l = 365 nm (Pramono, 1989). Dengan adanya fraksi yang memberikan noda dengan harga Rf yang sama dapat digabungkan. Fraksi gabungan diangin – anginkan selama seminggu agar pekat dan mudah terdeteksi pada saat KLT. Fraksi yang positif mengandung senyawa flavonoid dan memberikan noda tunggal pada kromatogram, dimurnikan melalui rekristalisasi. Hasil rekristalisasi diamati dengan KLT menggunakan berbagai eluen. Pelarut dari kristal yang telah diperoleh dipisahkan dan kristal disimpan dalam desikator.

Identifikasi Senyawa Flavonoid

Senyawa flavonoid yang diperoleh dikarakterisasi dengan titik leleh, Spektroskopi UV – Vis dan IR. Penentuan titik leleh, Spektroskopi FT – IR dan spektroskopi UV – Vis dari senyawa isolat dikirim ke Laboratorium Kimia Organik UGM Yogyakarta. Titik leleh dari kristal dapat ditentukan dengan pemanasan kristal. Kristal ditempatkan pada alat yang telah tersedia kemudian suhu dari kristal disaat mulai meleleh diamati sampai suhu dimana semua kristal telah habis meleleh. Spektrum senyawa isolat untuk UV – Vis ditentukan dalam larutan etil asetat.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil Penelitian

Ekstraksi daun tumbuhan sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) dilakukan dengan cara maserasi 250 gram serbuk daun tumbuhan sirih merah kering menggunakan pelarut metanol, sehingga diperoleh ekstrak kasar metanol. Ekstrak kasar metanol difraksinasi menggunakan pelarut metanol – air, etil asetat, n-heksana. Kemudian dihasilkan tiga fraksi, yaitu fraksi metanol – air, fraksi etil asetat dan fraksi n-heksana. Setelah itu dilakukan penentuan perbandingan eluen untuk kromatografi kolom dengan uji KLT dan didapatkan pemisahan terbaik pada perbandingan eluen (20 : 80) n-heksana dan etil asetat. Sebanyak 2 gram ekstrak dari daun tumbuhan sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) dari fraksi etil asetat di kromatografi kolom dengan metode Isokratik dan diperoleh 155 vial. Vial – vial tersebut masing – masing dimonitoring dengan KLT menggunakan eluen n- heksana : etil asetat (20 : 80) dan diamati dibawah lampu UV,  = 365 nm setelah diberi penampak noda asam sitroborat. Vial – vial yang memiliki Rf yang sama digabungkan ke dalam satu fraksi sehingga diperoleh 13 fraksi. Fraksi 4 memberikan satu flurosensi warna orange setelah diberi penampak noda asam sitroborat yang menunjukkan adanya senyawa flavonoid dan memiliki hasil sebesar 0,02 gram. Setelah dimurnikan diperoleh kristal senyawa isolat berwarna hijau sebesar 0,01 gram. Pada uji KLT senyawa isolat memiliki nilai Rf 0,24 dengan eluen n-heksana : etil asetat (20 : 80) sedangkan nilai Rf pada metanol 0,35 dan Rf pada etil asetat 0,30. Titik leleh senyawa flavonoid hasil isolasi adalah 150 – 156⁰ C.

Hasil spektrum UV – Vis kristal senyawa hasil isolasi memberikan serapan pada panjang gelombang 269 nm dan 418 nm. Sedangkan hasil spektrum inframerah memberikan serapan pada angka gelombang (cm-1 ) : 740,67; 802,39; 933,55; 972,12; 1033,85; 1118,71; 1165,00; 1265,30; 1373,32; 1458,18; 1512,19; 1604,77; 1728,22; 2723,49; 2854,65; 2924,09; 3070,68; 3387,00.

Ekstraksi dan Fraksinasi Senyawa Flavonoid

Serbuk daun sirih merah kering sebanyak ± 250 gram diekstraksi dengan cara maserasi. Cara ini merupakan metode yang mudah digunakan untuk menarik komponen – komponen yang terkandung dalam sampel dengan menggunakan alat yang sederhana, cukup meredam sampel dengan pelarut. Perendaman sampel tumbuhan akan mengakibatkan pemecahan dinding dan membran sel akibat perbedaan tekanan antara didalam dan diluar sel sehingga metabolit sekunder yang berada di dalam sitoplasma akan terlarut dalam pelarut organik dan ekstraksi senyawa akan sempurna karena dapat diatur perendaman yang dilakukan (Darwis, 2000). Sampel dimaserasi dengan pelarut metanol sebanyak 10 L pada suhu ruang selama 3x24 jam sambil sesekali dikocok dengan shakerbath. Metanol digunakan sebagai pelarut awal karena metanol memiliki struktur molekul yang kecil sehingga mampu menembus semua jaringan tumbuhan untuk menarik senyawa aktif keluar. Metanol dapat melarutkan hampir semua senyawa organik, baik polar maupun non-polar, metanol mudah menguap sehingga mudah dipisahkan dari ekstrak (Waji RA, 2009). filtrat yang diperoleh diuapkan pelarutnya dengan cara vakum menggunakan rotavapor pada suhu 40⁰ C sampai semua metanol menguap sehingga diperoleh ekstrak kasar metanol berwarna coklat tua sebanyak 44,9409 gram. Evaporasi dilakukan pada suhu 35 – 40^oC untuk menghindari kerusakan senyawa metabolit sekunder karena beberapa senyawa metabolit sekunder mudah rusak pada suhu tinggi (Robinson, 1995).

Ekstrak kasar metanol kemudian difraksinasi bertahap dengan tujuan menyederhanakan senyawa metabolit sekunder yang terekstraksi. Fraksinasi dilakukan berdasarkan kepolarannya. Semua bahan yang diinginkan akan larut dalam satu pelarut, dan semua bahan yang tidak diinginkan akan larut dalam pelarut yang lain (Underwood, 1981). Flavonoid merupakan senyawa polar (Markham, 1988).

Fraksinasi ini menggunakan pelarut metanol-air, n-heksana dan etil asetat secara

berturut – turut (partisi cair – cair). Ekstrak kasar metanol yang diperoleh dilarutkan kembali dengan metanol-air dengan perbandingan 6 : 4 (Lopes, 2004). Ekstrak difraksinasi dengan n -heksana terlebih dahulu untuk menarik semua senyawa metabolit sekunder yang bersifat non-polar. Fraksinasi dengan

n-heksana dilakukan hingga larutan hasil fraksinasi dengan n -heksana sudah tidak berwarna lagi. Fraksinasi yang berulang – ulang bertujuan agar senyawa metabolit sekunder benar – benar terpisah. Kemudian fraksinasi dengan cara yang sama dilanjutkan dengan etil asetat untuk menarik semua senyawa metabolit sekunder yang bersifat semipolar. Dari hasil fraksinasi diperoleh tiga

fraksi yaitu fraksi n -heksana, fraksi etil asetat dan fraksi metanol – air.  Tiap – tiap fraksi diuji fitokimia untuk mengetahui ada tidaknya senyawa

flavonoid. Uji senyawa flavonoid dilakukan dengan cara menambahkan sedikit serbuk Mg dan 3 tetes HCl pekat dan uji senyawa flavonoid dinyatakan positif jika reaksi yang terjadi menghasilkan warna merah, kuning atau jingga (Harbone, 1987).

Dari uji fitokimia, ekstrak etil asetat positif mengandung flavonoid karena pada penambahan pereaksi warna tersebut terjadi perubahan yang khas untuk flavonoid. Perubahan warna yang terjadi diduga ekstrak etil asetat mengandung senyawa flavonoid golongan auron. Fraksi etil asetat yang diperoleh diuapkan pelarutnya secara vakum menggunakan rotavapor pada suhu 40^o C sampai seluruh pelarut teruapkan. Dari hasil rotarvapor diperoleh ekstrak sebesar 4,07 gram pada fraksi etil asetat. Terhadap ekstrak etil asetat ini selanjutnya dilakukan uji pemisahan dan pemurnian. Pemisahan dan Pemurnian Senyawa Flavonoid Pada fraksi etil asetat yang positif flavonoid ini dilakukan kromatografi lapis tipis (KLT) untuk mencari fase gerak yang memberikan pemisahan terbaik. Setelah memperoleh fase gerak yang terbaik dilakukan kromatografi kolom untuk memisahkan komponen – komponen yang ada pada fraksi etil asetat. Dari berbagai fase gerak yang digunakan, fase gerak n -heksana : etil asetat (20 : 80) yang memberikan pemisahan terbaik, dengan memberikan 5 buah noda setelah diuapi iodin sebagai penampak noda. Sehingga fase gerak ini yang digunakan dalam kromatografi kolom.

Dari data hasil KLT, fraksi etil asetat dikromatografi kolom untuk memisahkan

beberapa senyawa yang ada di dalam fraksi etil asetat menjadi senyawa yang murni. Metode yang dipilih pada kromatografi kolom adalah metode

Isokratik yang didasarkan pada uji pendahuluan dalam pemilihan eluen yang baik dalam pemisahan senyawa – senyawa metabolit sekunder. Eluen tersebut kemudian digunakan dalam proses isolasi. Terhadap 2 gram fraksi etil asetat dilakukan proses pemisahan dengan menggunakan fase diam silika gel 60 (35 – 70 mesh) 100 gram (panjang kolom 45 cm, diameter 3 cm), menggunakan fase gerak n -heksana : etil asetat (20 : 80). Silika gel disuspensikan lebih dahulu dengan eluen (20 : 80) n- heksana : etil asetat lalu dimasukkan ke dalam kolom yang dasarnya telah diberi kapas dan didiamkan semalam untuk memadatkan kolom (Ratnasari, 2008). Setelah itu 2 gram fraksi etil asetat dilarutkan dengan sedikit etil asetat dan dimasukkan ke dalam kolom. Kemudian dielusi dengan menggunakan metode Isokratik. Hasil kromatografi kolom adalah 155 vial (tiap fraksi ±10 mL). Vial – vial yang diperoleh diangin – anginkan selama seminggu agar pekat dan mudah terdeteksi pada waktu KLT. Selanjutnya 155 vial diuji dengan KLT untuk penggabungan menggunakan eluen n -heksana : etil asetat (20 : 80) dan penampak noda asam sitroborat lalu diamati dengan

lampu UV l= 365 nm. Penampak noda asam sitroborat dengan senyawa flavonoid diduga dapat membentuk ikatan pada kedudukan yang lain dengan campuran asam borat dan asam sitrat pada pemanasan. Sampai saat ini mekanisme yang terjadi pada flavonoid dan asam sitroborat belum diketahui pasti. Sedangkan flourosensi yang terbentuk adalah flourosensi kuning – kuning kehijauan atau orange dibawah lampu UV l = 365 nm (Pramono, 1989).

Vial – vial yang memiliki Rf sama digabungkan ke dalam satu fraksi gabungan.

Setelah semua diuji KLT dilakukan diperoleh 13 fraksi gabungan seperti yang

ditunjukkan pada tabel 1. Masing – masing fraksi gabungan diuji kembali dengan KLT dengan eluen n-heksana : etil asetat (20 : 80) dan penampak noda yang digunakan asam sitroborat lalu diamati dibawah lampu UV l= 365 nm. Fraksi 4 memberikan satu noda yang memiliki fluorosensi warna kuning sebelum disemprot penampak asam sitroborat dan warna orange sesudah disemprot asam sitroborat. Fraksi ini memiliki hasil sebesar 0,02 gram. Fraksi 4 berupa kristal berwarna hijau. Tabel 1. Fraksi gabungan hasil kromatografi kolom yang telah di uji KLT

 

 KESIMPULAN

Senyawa flavonoid yang bersumber dari daun tumbuhan sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) pada fraksi etil asetat dapat diisolasi dengan cara diekstraksi melalui maserasi, fraksinasi, kromatografi dan rekristalisasi. Sehingga diperoleh kristal berwarna hijau dengan titik leleh senyawa isolat 150 – 156 C dan nilai Rf yaitu 0,24 pada eluen n-heksana : etil asetat (20 : 80). Sedangkan Rf pada berbagai pelarut pada metanol 0,35 dan etil asetat 0,30. Pada daun tumbuhan sirih merah ( Piper crocatum Ruiz & Pav)

diduga terdapat golongan senyawa flavonoid auron.

PERMASALAHAN:
dengan fraksinasi antara fraksi metanol – air dengan pelarut etil asetat dengan perbandingan 1 : 1. Sehingga dihasilkan 3 fraksi, yaitu fraksi metanol – air, fraksi etil asetat dan fraksi n– heksana.
 sementara fraksi yang digunakan adalah fraksi etil asetat.

• mengapa yang digunakan adalah fraksi etil asetat,?
• bagaimana dengan fraksi lainny? apakah perlu atau tidak dilakukan pemekatan dan identifikasi. jika ya, apakah kemungkinan dihasilkan hasil yang sama?

 pada ekstraksi digunakan eluen (20 : 80) n- heksana : etil asetat. 

• mengapa digunakan perbandingan tersebut.? bagaimana jika digunakan perbandingan sebaliknya.